常見問題
原因1：樣本中的雜蛋白影響了介質(zhì)與目的蛋白的親和
原因 | 解決方案 |
大部分雜蛋白分子量小于目的蛋白，可能是目的蛋白降解 | 1.裂解過程中加入蛋白酶抑制劑（如PMSF） 2.降低超聲破碎的功率和時間 |
雜蛋白與目的蛋白相互作用，共同被洗脫 | 細(xì)胞破碎前加低濃度還原劑或去污劑減少非特異性作用 |
雜蛋白與介質(zhì)親和力太強(qiáng) | 提高樣品介質(zhì)結(jié)合起始咪唑濃度 |
樣品中含有其他的組氨酸標(biāo)簽蛋白 | 1.調(diào)節(jié)pH或咪唑濃度優(yōu)化洗雜條件； 2.使用多步純化法進(jìn)一步純化洗脫組分（如離子交換，疏水等）； 3.使用雙標(biāo)簽純化（如同時在重組蛋白上添加His標(biāo)簽和Strep II標(biāo)簽） |
原因2：操作或介質(zhì)選擇不當(dāng)
原因 | 解決方案 |
洗雜操作不徹底 | 增加Wash Buffer體積 |
介質(zhì)中金屬離子選擇性較弱 | 優(yōu)化過渡金屬離子種類：可以采用選擇性更高的Co2+作為過渡金屬離子，使得含有組氨酸的雜蛋白無法吸附在介質(zhì)上 |
介質(zhì)中配體選擇性較弱 | 優(yōu)化層析介質(zhì)種類：可以采用純度較高的Smart介質(zhì)代替IDA與NTA作為層析介質(zhì) |
原因1：目的蛋白不掛柱
原因 | 解決方案 |
菌體未裂解 | 判斷方法：取裂解上清，電泳檢測是否含有目的蛋白 1.調(diào)整超聲功率2.改變裂解方式（如化學(xué)裂解法） |
蛋白表達(dá)為包涵體 | 參考包涵體純化方法 |
His標(biāo)簽斷裂丟失 | 判斷方法：通過WB檢測His標(biāo)簽 1.調(diào)整破碎條件，加入蛋白酶抑制劑 2.His標(biāo)簽設(shè)計(jì)在蛋白N端 |
標(biāo)簽未充分暴露 | 1. 參考包涵體純化方法，在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑使標(biāo)簽暴露。 2. 改變His標(biāo)簽位置或增加His標(biāo)簽長度提高標(biāo)簽暴露 |
目的蛋白表達(dá)量低 | 優(yōu)化表達(dá)條件（查） |
原因2：目的蛋白結(jié)合弱
原因 | 解決方案 |
目的蛋白在洗雜步驟被洗脫 | 判斷方法：電泳檢測洗雜液中是否含有目的蛋白 1.降低Wash Buffer中咪唑濃度； 2.增加Wash Buffer的pH； 3.延長結(jié)合時間，改變結(jié)合條件 |
介質(zhì)中金屬離子結(jié)合力較弱 | 優(yōu)化過渡金屬離子種類：可以采用結(jié)合力更強(qiáng)的Cu2+作為過渡金屬離子，增加目的蛋白與介質(zhì)間結(jié)合作用 |
純化介質(zhì)中Ni2+被剝離 | 1.如填料顏色變淺，可通過填料再生，重新掛Ni2+ 2.如緩沖液中含有DTT、EDTA等試劑，調(diào)整試劑濃度或者選擇Ni NTA Beads 6FF/Ni Smart Beads 6FF |
原因3：目的蛋白洗脫不下來
原因 | 解決方案 |
洗脫條件太溫和 | 1.提高Elution Buffer中咪唑濃度 2.降低Elution Buffer的pH |
目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng)導(dǎo)致咪唑無法競爭洗脫 | 1.可采用螯合能力弱的Co2+作為過渡金屬離子，降低目的蛋白與介質(zhì)間結(jié)合作用； 2.減少蛋白與介質(zhì)結(jié)合時間 |
目的蛋白形成聚集體遮擋結(jié)合位點(diǎn)使咪唑無法競爭洗脫 | 選擇EDTA脫鎳洗脫，再通過透析或超濾換液方式去除EDTA、Ni2+和DTT |
蛋白與介質(zhì)發(fā)生非特異性疏水或其他相互作用 | 1.在洗脫液中加入非離子型去污劑； 2.增加NaCl的濃度 |
上樣過程中蛋白發(fā)生沉淀 | 1.常規(guī)結(jié)合溫度：16-28℃，也可以選擇低溫結(jié)合：2-8℃ 2.若蛋白發(fā)生聚集，可在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑（如0.1％的Triton X-100或Tween-20） |
緩沖液pH≥目的蛋白pI 0.5-3個單位，蛋白帶負(fù)電，選擇弱陰離子交換填料(DEAE)；
緩沖液 pH≥目的蛋白pI 3個蛋白以上，蛋白帶負(fù)電，選擇強(qiáng)陰離子交換填料(Q)；
緩沖液 pH≤目的蛋白pI 0.5-3個單位，蛋白帶正電，選擇弱陽離子交換填料(CM)；
緩沖液 pH≤目的蛋白pI 3個單位以上，蛋白帶正電，選擇強(qiáng)陽離子交換填料(SP)；
緩沖液中含有較高離子強(qiáng)度時選擇復(fù)合型離子交換填料(MMC/MMA)。
強(qiáng)陰/陽離子交換劑：適用pH范圍廣，pH范圍內(nèi)結(jié)合效果更穩(wěn)定；
弱陰/陽離子交換劑：適用pH范圍窄，載量隨著pH變化，分辨率較高；當(dāng)用強(qiáng)陰/陽離子無法滿足分離效果時，可以選擇。
Streptactin Beads 4FF建議用脫硫生物素洗脫，不能用D-生物素洗脫，原因是D-生物素與填料結(jié)合非常緊密，高濃度氫氧化鈉清洗后載量只能達(dá)到初始載量的 50%左右。每次用完都需要再生。
STarm Streptactin beads 4FF洗脫液為D-生物素，可以耐受高鹽和變性劑等試劑，也可以在微量游離生物素濃度下結(jié)合目的蛋白。使用完后可以用PBS進(jìn)行清洗，無需每次再生。
Streptavidin Beads 6FF適用于生物素化蛋白、抗體等組分的親和；
Streptactin Beads 4FF適用于Strep-tag Ⅱ標(biāo)簽融合蛋白、Twin Strep-tag Ⅱ標(biāo)簽融合蛋白的親和。
IDA | NTA | Smart | |
載量 | 較高 | 較高 | 較低 |
蛋白純度 | 較低 | 中等 | 較高 |
耐受試劑 | 常規(guī)純化試劑，不耐受還原劑，變性劑，EDTA等 | 耐受低濃度還原劑，EDTA和變性劑 | 耐受一定濃度還原劑，EDTA，變性劑和氫氧化鈉 |
純化樣本 | 原核可溶蛋白 | 原核可溶蛋白或包涵體 | 真核胞內(nèi)外蛋白，無需換液 |
再生方法 | 脫鎳再生 | 脫鎳再生 | 氫氧化鈉清洗 |
適用性 | 載量高，性價比高 | 適用性更廣，配體更穩(wěn)定，選擇性更高 | 很強(qiáng)的組分兼容性，適用于廣泛底物及鹽濃度的緩沖條件 |
（1）血清可先用Protein G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG?；蜻x用IgG含量較低的血清。
（2）樣品先用Protein A或G純化，得到的抗體再經(jīng)過疏水層析除去牛IgG。
（1）首先看樣品是否結(jié)合，抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力，結(jié)合緩沖液pH是否中性，流穿中抗體是否有減少，可將原始樣品和流穿同時跑SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
（2）再看樣品是否與填料結(jié)合太牢固，沒有洗脫下來，建議用pH更低的緩沖液洗脫。
（3）洗脫后酸性條件下抗體是否水解，可在收集管中預(yù)先加入中和液或精氨酸等保護(hù)劑，或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。
（1）洗雜是否完全？可取zui后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
（2）適當(dāng)提高結(jié)合時鹽離子濃度，或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑，降低非特異性吸附。
（3）上樣前樣品預(yù)處理，除去部分雜質(zhì)。
（4）采用兩步純化，先親和層析純化，后經(jīng)離子交換層析，除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等，得到純度更高的抗體。
（1）Protein L可以特異性的結(jié)合抗體的κ輕鏈，因此，只要Fab 片段中含有κ輕鏈，就可以選擇Protein L填料進(jìn)行純化。
（2）Protein G 除了可以特異性結(jié)合IgG 的Fc 片段，還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結(jié)合。
（3）Protein A只結(jié)合IgG的Fc片段。采用流穿模式，將純的IgG酶解后過Protein A填料，F(xiàn)ab在流穿峰，F(xiàn)c片段結(jié)合在填料上。
（1）更換親和力更高的填料。
（2）對于Protein A填料，結(jié)合pH可以升至8-9。
（3）填料多次使用后殘留物增多，載量降低，建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。
（1）通常采用沉淀法結(jié)合凝膠過濾法純化IgM，但對于大量純化抗體，這種方案繁瑣且產(chǎn)量低。
（2）采用Protein L親和填料，特異性的結(jié)合κ輕鏈，對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。
（3）嗜硫填料是根據(jù)其配基與抗體間的二硫鍵產(chǎn)生特異性相互作用，中性條件下吸附、洗脫，純化后蛋白活性高，是一種通用型抗體純化手段。
最常用的預(yù)處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白，常用硫酸右旋葡糖酐沉淀，或是在pH=7時，采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白，可以使用分級沉淀法去除，如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。
